百欧林 May 23, ’04

华南理工大学杨晓泉等:采用等温滴定量热法、耗散型石英晶体微天平和Langmuir单层膜制备技术研究大豆7S球蛋白多肽与细胞膜模型之间的相互作用

华南理工大学杨晓泉等:采用等温滴定量热法、耗散型石英晶体微天平和Langmuir单层膜制备技术研究大豆7S球蛋白多肽与细胞膜模型之间的相互作用

 

摘要:为了了解大豆7S球蛋白降胆固醇作用的内在分子学机理,本文系统性研究了胃蛋白酶释放多肽(7S肽)与由二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)和胆固醇(CHOL)组成的细胞膜模型之间的相互作用。结果表明: 7S-肽主要通过范德华力和氢键与DPPC / DOPC / CHOL脂质体结合,而且胆固醇浓度越高,结合亲和力越强(例如,当DPPC / DOPC / CHOL = 1:1:0时,结合率= 0.114; 当DPPC / DOPC / CHOL = 1:1:1时,结合率= 2.02)。LB膜等温压缩研究结果表明,7S-肽的加入增加了DPPC / DOPC / CHOL单层磷脂膜的流动性和脂筏尺寸。 胆固醇的存在加速了脂筏上7S-肽的积累,这可以作为肽发展形成富含β-折叠结构的平台。这些结果使我们可以推测7S-肽可能通过改变肠上皮细胞的膜组织间接影响膜蛋白功能。

关键词:7S-肽,细胞膜模型,脂质体,Langmuir单层膜,相互作用

测量方法:

耗散型石英晶体微天平(QCM-D):

本文使用耗散型石英晶体微天平QCM-D(瑞典百欧林科技有限公司,QSense)深入研究了7S-肽和脂质体之间的相互作用。在测试前,用pH7.4 PBS缓冲液将7S-肽和脂质体稀释至0.1%(w / v)的浓度。在25℃的温度下,依次加入PBS缓冲液(基线,10分钟),脂质体悬浮液(60分钟),PBS缓冲液(冲洗,10分钟),7S-肽溶液(40分钟)和PBS缓冲液(冲洗,10分钟),记录实验期间金涂层石英晶体芯片的归一化频率变化(Δ f)和耗散值变化(ΔD)。注射速率为0.1mL / min。在每次实验之前和之后,将芯片在硫酸 – 过氧化氢(3:1,v / v)混合溶液中超声处理10分钟,用Milli-Q水洗涤,然后用氮气干燥。微量天平部分也用Milli-Q水冲洗并用氮气干燥。所有实验均进行三次重复。

LB膜分析仪:

检测7S-肽与Langmuir脂质单层膜之间的相互作用,在25℃下测量表面压(Π) – 面积(A)等温线,通过使用称重方法校准的铂Wilhelmy板(周长39.44mm,KSV,芬兰)研究7S-肽和脂质Langmuir单层之间的相互作用。本研究中使用芬兰KSV NIMA 生产的Langmuir液 – 液槽(总面积为40176mm2),并配备两个亲水性Delrin滑障。在测量之前,将300mL pH 7.4 PBS缓冲液作为子相倒入Langmuir槽中,通过抽吸、清洗和压缩液体界面直至表面压力低于0.5mN / m,确保无表面活性剂污染。将DPPC / DOPC / CHOL摩尔比分别为1:1:0,1:1:0.2和1:1:1的三元混合磷脂溶于氯仿/甲醇混合物中,混合体积比为2:1,用Hamilton注射器将一滴40μL样品(1mg / mL)缓慢滴在亚相界面上。待溶剂蒸发和脂质扩散20分钟后,将脂质/肽摩尔比分别为1:0,1:0.12,1:0.40和1:0.78的7S-肽溶液滴在子相上。平衡30分钟后,两个压缩滑障开始以8mm/min的速率压缩。所有实验均进行三次重复。

形态学观察,在Langmuir槽上同时安装了一个自动镀膜装置,用于将Langmuir- Blodgett (LB)单分子层沉积到固体基底上。当表面压力达到预期值时,通过垂直拉力以2mm /min的恒定速度将LB单层膜转移到一个干净的玻璃载玻片或一个新切割的云母片上。在空气中干燥1小时后,用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和原子力显微镜(AFM)观察得到的薄膜。

图1:7S-肽和混合磷脂脂质体之间相互作用的Δf -t和ΔD-t图,其中DPPC / DOPC / CHOL摩尔比分别为1:1:0(A)和1:1:1(B)。 时间点(i),(ii),(iii)和(iv)分别对应于脂质体添加,PBS缓冲液冲洗,7S-肽添加和PBS缓冲液冲洗。 所示数据均来自第三倍频(n = 3)。

图2:表面压(Π)——单层的面积(A)等温线,DPPC / DOPC / CHOL摩尔比分别为1:1:0(A),1:1:0.2(B)和1:1:1( C),脂质/ 7S-肽的摩尔比分别为1:0.00,1:0.12,1:0.40和1:0.78。

单层的表面压(Π) – 静态弹性模量(E0)等温线,DPPC / DOPC / CHOL摩尔比分别为1:1:0(A’),1:1:0.2(B’)和1:1:1 (C’),脂质/ 7S-肽的摩尔比分别为1:0.00,1:0.12,1:0.40和1:0.78。

 

以上成果发表在Agric. Food Chem.上(2018.4.10),更多详情请阅读论文原文:https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021%2Facs.jafc.8b00414

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