蛋白质是构筑生命体的最基本结构与功能单元，将蛋白质固定在无机界面上对于开发其更多独特的应用来说是十分重要的。许多物理和化学的偶联固定技术也因此诞生。但是这些技术的应用往往需要苛刻的条件来实现，在固定的过程中容易导致蛋白质构象发生变化，从而失活。层层组装是一种操作简单，条件温和的组装技术。如果能够结合层层组装精确控制层级成份的技术优点，再开发出具有高效性、温和性的偶联技术将为蛋白质固定，特别是酶的固定方面提供了一个新的思路。
针对这一问题，近日东华大学杨曙光教授与北京大学张文彬教授合作发表了一篇题为：“SynergisticEnhancement of Enzyme Performance and Resilience viaOrthogonal Peptide-Protein ChemistryEnabled Multilayer Construction” 在Biomacromolecules上。文中使用百欧林的耗散型石英晶体（QCM-D）微天平进行了大量的研究工作。本文摘录文章部分内容供大家参考。
测量方法：
研究团队使用了QSense公司生产的具有耗散功能的石英晶体微天平QCM-D。首先对芯片进行处理，采用多次乙醇/超纯水高速冲洗后N2吹干备用。蛋白质溶液的浓度为0.5mg/ml, 溶于PBS（pH7.4）缓冲液中。组装前，所有溶液过0.22μm 的滤膜，随后3500 rpm以上高速离心30 min去除气泡。蠕动泵的流速设置为50μL/min。对于蛋白组装实验，组装液的组装时间为20-30 min，清洗时间为20 min。
图1.（A）全蛋白层层组装薄膜制备（B）蛋白质层层组装构筑单元的构建
研究团队基于之前设计的、能够制备全蛋白质层层组装薄膜的正交蛋白质反应对CBC与DAD（Biomacromolecules 2018, 19 (3), 1065−1073）进行进一步开发，将多种具有多种生物响应性和生物活性的折叠蛋白质结构域引入到其中，制备出具有生物响应性和生物功能性的蛋白质层层组装构筑单元CBC-X（图1）。其中X可以使具有构象可以发生巨大变化的钙调蛋白（Calmodulin），具有生物催化活性的二氢叶酸还原酶（DHFR）以及Affibody。
图2. QCM-D实验数据：Δf/n随时间及组装层数的变化
通过对其组装出来的薄膜进行表征发现，这些新的蛋白质层层组装构筑单元都可以成功地制备出蛋白质薄膜，并且具有舒展型构象的蛋白结构更有助于蛋白质层层组装薄膜的生长（图2a-c）。除此之外，这种蛋白质薄膜能够扩展到多种无机界面上，甚至还能够进一步功能化。通过QCM-D实验可以证明，薄膜中的X结构域仍然能够保持其生物响应性以及生物活性（图2d-f）。功能化薄膜组装的实现也创造了可以搭载多种功能性折叠蛋白质的平台。
图3. 全蛋白质层层组装薄膜的生物响应性和生物活性
最重要的是这种薄膜还能很好地继承其构筑单元所独有的生物响应性和生物活性（图3）。以DHFR为例，首先薄膜中DHFR的含量与薄膜层数之间存在着良好的线性相关关系。薄膜中的DHFR成分能够很好地保持其催化活性，并且由于多层膜结构而导致的协同效应，导致其活性以及稳定性进一步增强。值得一提的是相比于野生型DHFR，薄膜中的DHFR经过冻干后还能保持足够的活性。针对许多功能性蛋白难以储存，运输等问题，这一工作对于蛋白质固定领域的研究提供了一个新的思路，也为开发功能性蛋白质材料打下了基础。
以上结果发表在Biomacromolecules上，（2018, 19, 2700-2707），更多详细内容请阅读原文：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.biomac.8b00306
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